病毒感染是某些肿瘤的重要诱发因素，经研究证明：宫颈癌的发生与人乳头瘤病毒(HPV)感染密切相关。人体内确定的HPV有85种以上［1］。其中与宫颈癌发生有关的有20多种，可分为高危型、中危型、低危型三种，其中高危型组的HPV16、HPV18等与宫颈癌有密切联系。本文仅从高危型HPV的分子生物学和致癌机理，引起HPV感染导致宫颈癌的因素及其预防和治疗，结合最新研究进展综述如下。
1 高危型HPV的分子生物学及其致癌机理
HPV是无包膜的20面体对称的核衣壳病毒，表面有72个壳微粒，它的基因结构为双股环状DNA，由三个基因区组成：两个蛋白编码区即E基因（早基因区）和L基因（晚基因区），一个编码的上游调节区和长调控区（Long control region，LCR），LCR位于E基因上游，不编码蛋白，含有不同转录受体和激活因子的重叠结合区：控制E、L基因的转录和病毒合成。早期基因有7个开放读码框架：E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7。其中E2、E6、E7是病毒癌基因（v－onc），E2的编码蛋白主要起转录调节作用，充当E6、E7的阻碍物，E1是病毒复制的编码蛋白，编码蛋白可能是DNA聚合酶功能蛋白，使病毒增殖。E6、E7编码蛋白可调控病毒生长与繁殖，可能参与调节人L基因的转录。E4编码晚期胞质蛋白［2］，E5基因可能是人细胞永生化和转化的潜在介质，E3研究尚不清楚。L蛋白则主要编码衣壳蛋白。
子宫颈的鳞状上皮细胞与柱状上皮细胞的连接处是HPV的易感部位。HPV感染宿主细胞后，可以二种形式存在于宿主细胞中：即细胞染色体的整合状态和染色体的游离状态。有文献报道：宫颈癌细胞中HPV16、HPV18的DNA绝大部分呈整合形式，在浸润性宫颈癌中，则以游离和整合形式共存。对于HPV的整合，多数学者认为HPV并非随机插入宿主基因组，而是常整合于宫颈上皮细胞基因组不稳定区和转录活跃区并抑制其功能［3］，例如整合于Rb抑癌基因所在位点，破坏Rb蛋白的抑癌功能而导致癌变。
1.1 P53和E6、E7与宫颈癌
1.1.1 E6、E7蛋白的扩增表达 在HPV和LCR基因中，有多个转录激活因子和转录抑制基因的结合位点。在HPVE6、E7共同启动子P97上游有三个E2的特异结合位点，在LCR中有与转录调节蛋白YY1的结合位点：E2蛋白和转录蛋白YY1都有抑制E6、E7转录的作用，抑制P97的活性，在HPV整合宿主细胞染色体时可在E2的ORF区断裂后整合导致E2片断缺失，这样E2蛋白抑制E6、E7转录的功能失效，使E6、E7大量扩增表达。另外有实验资料显示［4］，在HPV宫颈癌良性细胞中的YY1点好发生点突变，导致宫颈细胞、人类传代角质细胞及多种上皮细胞中转录调节蛋白YY1不能和LCR上的YY1结合而发挥其抑制E6、E7大量扩增表达的作用，这相当于病毒逃避了宿主细胞的免疫抑制系统，使E6、E7蛋白诱发肿瘤的发生。
1.1.2 P53蛋白、Rb蛋白与E6、E7蛋白相互作用导致癌变的机理 P53蛋白是一类抑癌物质，它可以调控P21的转录表达。P21蛋白又是细胞周期蛋白激酶（Cyclin dependent kinase，CDK）的抑制剂。CDK可使Rb蛋白等抑癌物质磷酸化。正常的Rb蛋白能和E2F结合形成复合物，使E2F丧失与DNA的亲合性，使E2F不能发挥转录功能，磷酸化的Rb蛋白则失去了此功能，E2F转录表达的蛋白c－myc胸腺激酶、DNA聚活酶，都是细胞周期由G0进入G1期所需要的功能蛋白，促使细胞分裂增殖。当细胞DNA损伤时，P53间接作用使细胞停于后期或使细胞凋亡［2］。而E6可以与P53结合形成复合物，加速P53降解，使P53抑制细胞生长增殖作用消失，诱导癌变。E7蛋白可以与Rb蛋白结合使其磷酸化而与E2F解离，不能抑制E2F的转录而使细胞分裂增殖［5］。另外E7是阻止Rb蛋白与DNA结合而发挥其抑制细胞生长的功能，其诱导癌变作用机理还不清楚，可能是Rb蛋白与DNA结合后阻碍E2F的转录所致。
1.2 C－Ha－ ras癌基因，HPV与宫颈癌的关系
据报道：ras癌基因的改变在宫颈癌中的检出率为60%，Der等报道caskr宫颈癌细胞中有C－ha－ras基因产物P21表达，P21蛋白能与GTP和GDP结合，并且有GTP的酶活性，但P21与GTP结合时通过信息传递系统使DNA合成信息发出使细胞分裂增殖，同时GTP转化为GDP。P21与GDP结合后无促生长的活性［5］。有资料报道，HPV感染的宫颈癌中在Ⅱ、Ⅲ期ras基因有几位密码突变，早期有H－ras过度表达，突变后的P21产物与GTP结合力降低，但GTP酶活性降低，较难使GTP水解为GDP。这样自身调节受阻使宿主细胞无休止的分裂而呈恶性变化，近年来研究发现，HPV16、HPV18与原癌基因作用密切。另外还发现E7蛋白作为病毒癌蛋白，能与活化的H－ras癌基因协同转化原代细胞，其作用机制不清楚，可能是E7蛋白在此充当C－H－ras的转录调节蛋白，在早期使H－ras过度表达，在Ⅱ、Ⅲ期突变后进一步协同癌基因转化原代细胞。
1.3 C－myc癌基因、HPV病毒与宫颈癌
Rioa等发现宫颈癌中c－myc癌基因有扩增或过量表达［5］。Couturler等发现宫颈癌浸润癌细胞中，HPV16、HVP18DNA片段整合于宿主细胞中时部分靠近c－myc部位，致使c－myc过量表达。作用机制可能是病毒基因为c－myc提供了LCR中较保守增强于序列或者启动子，而导致了c－myc过量表达。C－myc的编码产物为核蛋白，往往调节一些重要蛋白的转录（如功能蛋白DNA酶等），这些功能蛋白可作用于细胞分裂增殖时，但核蛋白过多表达时可使这些重要蛋白产物增多而诱导癌变，这可能是其作用机制。
近来有文献报道HPV16等感染后原癌基因c－myc、H－ras、c－erbB2基因相互作用而致癌，HPV16整合于宿主细胞染色体以后，启动c－myc癌基因，为癌变起始因素。Ha－ras点突变及C－erbB2基因的重排或扩增为中晚期事件［6］。C－erbB2基因编码蛋白为跨膜蛋白P185与P21信号转导系统，当P21发生突变和P185发生扩增表达时，更易促使宿主细胞癌变，但整个作用机制不清楚。
2 HPV的易感因素和决定HPV感染的因素
2.1 HPV的类型
在对生殖道粘膜有感染力的30余种HPV病毒中，其致癌能力和后果也有差异。目前研究结果显示，HPV16与宫颈鳞癌关系最为密切，而HPV18最易导致宫颈腺癌［7］。
2.2 受感染的细胞的类型
HPV感染具有宿主和组织特异性，只能感染人的皮肤和粘膜上皮。在对宫颈癌的研究中发现，成熟的鳞形上皮细胞是HPV获得复制和繁殖的条件。研究表明，宫颈癌常发生于与宫颈外口鳞形上皮和柱状上皮的交界处和转化带，且主要累及储备细胞［8］。
2.3 机体的免疫状态
HPV感染的结局与机体的免疫状态有很大的关系。研究者认为，细胞免疫在抵抗HPV感染时起主要作用。在T淋巴细胞功能受损时，则易出现HPV感染。如有症状的AIDS患者，慢性移植性排斥反应的患者和长期使用免疫抑制剂的患者，其HPV感染率比正常人高得多［8］。同时研究者在许多伴随有HPV感染的良、恶性疾病的患者血清中发现了特异性HPV蛋白和壳粒抗原，表明体液免疫也参与了HPV感染后的细胞内调控。
2.4 协同因素
（1）体外细胞转化研究发现HPV仅能诱导正常上皮细胞的永生化而不能使之充分恶化，这表明HPV并非宫颈癌发生发展的唯一因素［9］。研究者发现，人巨细胞病毒（HCMV）整合在细胞染色体中协同HPV16促进宫颈上皮细胞的恶性转化。刘朝奇经细胞培养和动物试验证明，HCMVIE2基因是HPV导致宫颈癌发生的一个因素。
（2）肿瘤对某些激素有依赖性，Gopalkrishna等发现在印度妇女中HPV感染率随怀孕次数和时间增加。其调查结果显示，孕妇组比非孕妇组的HPV感染率至少高2倍，孕晚期是孕初期的1.6倍，其孕妇组中感染最高的是第五次妊娠（66.7%)，最低的是首次妊娠（31.1%）,［8］研究者认为这可能与孕期激素的影响有关，宫颈癌分子生物学研究揭示了孕激素和糖皮质激素在宫颈癌形成中的作用。在HPV16、HPV18、HPV11型上有孕激素反应因子（PRE）和糖皮质激素反应因子（GRE）。现认为，PRE/GRE是HPVS基因调节的重要组成部分，在病毒基因复制方面起作用，在排卵周期中HPV表达被反复强化，并在妊娠过程中进一步激化，从而加速受感染细胞癌变。同时，口服避孕药也能增加HPV病毒感染的能力。
2.5 性生活史
性伴侣过多，性生活过早，性行为混乱，均可增加HPV感染率［7］。美国调查研究显示：16岁以前发生性生活患病的危险性为20岁以后的两倍多，有五个以上性伙伴的危险性增加五倍以上［10］。Murphy等经调查研究指出，1982年以来在苏格兰独身（离婚或寡居）女性中，宫颈癌大幅度增加，而且增加的趋势与苏格兰80年代后出现的性解放潮流是一致的，性伙伴过多可能是男性的阴茎感染女性，使女性对HPV易感。性生活过早使HPV易感是因为在青春早期，宫颈上皮为柱状上皮，并一直延伸到阴道，不能通过宫颈粘膜来防止病原体的感染。
2.6 吸烟
目前研究表明，烟碱的代谢产物已在宫颈粘膜中发现，这就意味着它直接作用于宫颈移行带的细胞。而易受HPV感染的细胞也存在于宫颈移行带内。故吸烟与HPV感染存在某种内在联系［7］。
3 HPV感染后的检测
face="宋体" 3.1 细胞形态学检测
宫颈细胞感染HPV后的特征变化是出现了特异性的挖空细胞，故而可通过各种方法来检测挖空细胞的存在，而证实HPV的感染。
3.1.1 普通光镜下的形态学检测 细胞学检测发现，HPV感染初期宫颈上皮中表层出现挖空细胞，表层有角化不全或过度角化现象，棘细胞和基底细胞增生，间质乳头增生，伸长且向表面突起。当不典型增生达下2/3以上时，原中、浅层湿疣和挖空细胞数目减少［11］。此时，用光学显微镜可见宫颈上皮组织表现为低分化鳞状上皮细胞癌的形态特点，如组织结构异型性明显，细胞成巢状或片状排列。细胞大小不一，可见灶状坏死，核分裂象多见，染色质粗大，核膜变厚，并有浸润周围肌组织的现象［9］。
3.1.2 原位杂交 HPV16、HPV18型感染的ISH阳性细胞表现为宫颈上皮表面中层细胞核，特别是挖空细胞核为蓝紫色颗粒产物，密集浓染。从慢性宫颈炎→ CIN→宫颈癌，随着宫颈病变逐渐加重，HPV杂交信号逐渐增强，阳性细胞由上皮层逐渐到棘层，分布由散在→ 簇状→ 弥漫状，细胞核阳性着色也逐渐增强［12］。
3.1.3 PCNA形态学检测 增殖细胞核抗原（PCNA）阳性产物主要产于细胞核中，也有部分出现胞浆着色。利用PCNA单克隆PL10检测宫颈病变组织中的PCNA表达，PCNA阳性细胞主要散在上皮基底细胞层中，着色淡，棘细胞层及角化层无阳性细胞，CIN组则多见于基底细胞，棘细胞层中。细胞异型性明显者着色深，挖空细胞PCNA阳性着色。宫颈组织中有PCNA阳性物质的细胞数量多，着色深，呈片状分布，向棘细胞分化的大细胞和基底样细胞阳性着色多见［12］。
3.2 分子生物学检测
3.2.1 HPV核酸的检测 HPV DNA的检测方法目前主要有核酸杂交和聚合酶链反应（PCR），其中PCR技术的敏感性高，特异性强。据现有研究证明：PCR技术检测宫颈癌中HPV阳性率达60～90%。如果用PCR辅以某些检测方法，则还能明显提高其检出率，在PCR结合地高辛标记探针杂交检测的实验中，其对宫颈癌组织中的HPV检出率比对照组凝胶电泳分析和聚合酶链反应结合斑点杂交分别高2.8%、11.8%［13］。
3.2.2 HPV16、HPV18、E6单抗SP法染色检测 HPV16、HPV18早期蛋白E6单抗能有效地说明感染组织中存在的HPV16、HPV18E6蛋白，染色过程通过用皂角对组织切片进行消化处理，充分暴露组织标本中的抗原决定簇，使HPV16、HPV18E6蛋白和其单抗结合，在用SP法染色其阳性标志为核内出现棕黄色颗粒。随着宫颈病变的加深，宫颈癌组织中的阳性物质数量增多，着色加深，范围扩大［14］。
3.2.3 E6、E7的检测 HPV的感染引起宿主的免疫反应，可通过检测HPV感染后的特异性抗体来检测HPV的存在，故而可采用E6、E7血清抗体检测法，刘天菊、刘华等对HPV16E6、E7血清抗体的检测中，其阳性率分别为76.83%、68.5%［15］。
此外，PCR扩增酶联免疫吸附法（PCR－ELISA）和计算机细胞扫描（CCT）在宫颈HPV感染中有高效率、高敏感和高特异性。由于宫颈癌中的32P－C－Ha－ras－1、c－myc－DNA癌基因阳性率高［13］，故用不同宫颈组织中DNA与上述癌基因进行分子杂交，对于宫颈癌检测有很大意义。
4 高危HPV所致宫颈癌的预防与治疗
4.1 制备基因疫苗
HPV基因功能区的L区包括L1和L2，L1晚期基因能刺激机体产生保护性抗体［16］，因此该基因的克隆在制备基因工程疫苗方面成为可行性。Donnelly用编码乳头瘤病毒L壳蛋白的DNA疫苗，在兔体内的抗感染效果，说明了基因疫苗用于治疗也是一个有效途径。Conson J［17］在防御16型乳头瘤病毒感染的疫苗中提到：子宫颈分泌物中存在的抗HPV16核壳蛋白的中和抗体可能具有保护作用，故而可制备HPV16疫苗以预防原发HPV16感染。现在对这种疫苗的研究已取得相当进展，据澳大利亚布里斯班消息：美国PDA已批准在美国进行宫颈癌的人乳头瘤病毒Ⅱ预防疫苗的Ⅰ期临床试验。
4.2 构建HPV16型E6、E7基因反义质粒
E6、E7两个开放读码框架及其表达产物在宫颈癌细胞中常被检出，且这两个框架具有转化能力，E6、E7基因的表达与否是宫颈癌发生及维持的必要条件，故而研究E6、E7基因的反义质粒干扰E6、E7基因的表达成为一种治疗宫颈癌患者的手段。曾萍、司静懿等在人乳头瘤病毒16型E6、E7反义质粒对人宫颈癌细胞恶性的逆转作用中，采用构建可为地塞米松诱导表达的人乳头瘤病毒16型E6、E7反义质粒利用磷酸钙沉淀法将其分别转染到HPV16阳性的宫颈癌细胞Cask：和HPV阴性的宫颈癌细胞C－33A中，地塞米松诱导反义质粒表达后，Cask：细胞失去其恶性表型，而C－33A细胞生长特性及恶性行为未发生变化［18］，证明了E6、E7基因反义质粒可成为一种治疗宫颈癌的方法。
4.3 重组病毒载体肿瘤疫苗的应用
由于HPV宿主细胞通过下调MHC1表达位点突变，下调抗原呈递，降低E6、E7抗原性，使肿瘤细胞免疫原性降低，逃避免疫系统的杀伤，这样使得肿瘤生物治疗效果很低，因此有人提出将肿瘤抗原肽的编码基因导入病毒载体，可能诱导出有效的杀肿瘤作用，故而有人把HPV16的E7基因重组于牛痘病毒表达载体，作为重组病毒载体治疗疫苗与E7蛋白分别免疫小鼠，均获得特异性CTL，据此Boassneu MEG用表达HPV16E6、E7（经处理失去致癌性，保留抗原性）的重组病毒载体治疗免疫8例晚期宫颈癌病人，所有病人均产生抗牛痘LgG抗体，3人出现HPV特异性抗体，HPV特异性CTL在免疫疫苗后前两周可以检测到，有2例分别在15和21个月后仍保持临床良好。说明疫苗诱导的ADCC和CTL有一定效应，但仍存在E6、E7表达量较低，免疫原性不高的问题。但随着对重组病毒载体肿瘤疫苗研究的逐步深入使之应用于临床治疗将成为可能［5］。
4.4 P53的应用
已经证实在人体内有抑癌基因P53，恶性肿瘤的发生均是致癌基因与抑癌基因相互作用的结果，HPV所致宫颈癌也不例外，关于P53与HPV的相互作用已在致癌机制中作了详细叙述。由于P53有很强的抑制细胞凋亡的能力，目前已被用于临床上作为基因治疗的一种方法。除此之外，P53蛋白的表达受DNA损伤的影响很大，而多数抗癌药物均属DNA损伤剂，因此P53的功能与肿瘤对某种特定抗癌药物的反应有很密切关系，P53在肿瘤中的突变会影响抗癌药物杀伤肿瘤的能力，有结果表明，含有突变型无活性的P53的肿瘤预后往往很差［5］，由于P53与预后治疗上的重要关系，可以采用激活宫颈癌内已丧失活性的P53或重新引入有活性的P53，从而达到治疗宫颈癌的目的。
4.5 其它
目前较流行的治疗方式是局部有破坏的治疗，如刀切、激光灼烧、液氮冷冻、电热凝、三氯乙酸或者普达非伦脂腐蚀等［7］。但这些方法只是针对可见的或病变的局部进行治疗，而HPV还可在临近接受治疗的组织中潜伏。因此，治疗后HPV感染的再发生率高。5－Fu是限制HPV的DNA和RNA合成的细胞毒性药物，局部注射收效显著，但它可造成化学性阴道炎，长期使用还可导致阴道粘膜的损伤，甚至阴道狭窄。也有人利用干扰素的抗病毒、抗增殖和免疫调节等作用，通过肌肉和病变局部联合用药的方法治疗HPV收效比较显著，但关于HPV所致宫颈癌的预防与诊疗至今还没有一个十分完美和实际可行的方法，对HPV感染的预防以及如何迅速准确的诊断，安全有效的治疗有待进一步解决。
5 结语
高危性HPV与宫颈癌关系密切，涉及漫长的生物学过程和复杂的机制，而且HPV致癌因素与易感因素还有待进一步研究。预防疫苗和治疗疫苗在动物实验中取得了理想效果，但面临临床实验还有不易克服的问题，针对宫颈癌的治疗性疫苗在动物实验中和临床实验中均取得了一定进展。而且，其中重组载体治疗疫苗值得深入研究，有可能成为一种有效的肿瘤治疗的分子生物学手段。
(编辑:温雅)
