区域淋巴结转移是影响非小细胞肺癌（NSCLC）预后的重要因素，其发生受到某些肿瘤相关基因的调控。胰岛素样生长因子(Insulinlike growth factor, IGF)包括两个类型，即IGF1和IGF2（合称为IGFs），它们促进细胞增殖并抑制凋亡，在肿瘤发生和发展中的作用越来越受关注。最近研究表明，IGFs在肺癌的发生和发展中可能起重要作用，但有关IGFs蛋白在NSCLC中表达与淋巴结转移的关系尚无报道。为此，本研究采用免疫组织化学方法及免疫印迹技术检测IGF1和IGF2在NSCLC组织中的表达，并探讨其与淋巴结转移的关系。
1 资料与方法
1.1 临床资料
65例肺癌标本为武汉同济医院1999～2001年因原发性肺癌而手术切除标本。所有病例术前未行放疗或化疗，无代谢性疾病。男35例,女20例；年龄36～71（57±8.9）岁；鳞癌37例，腺癌28例。按PTNM分类标准(UICC,1997):Ⅰ期21例，Ⅱ期14例，Ⅲ期21例，Ⅳ期9例。伴有区域淋巴结转移41例（为N1或N2转移，无N3转移病例），无转移24例。29例切片中含有癌旁肺组织。以同期手术切除的19例肺良性病变组织(非癌性)作对照；其中，男14例，女5例；肺炎性假瘤9例，支气管扩张症6例，肺错构瘤2例，肺平滑肌瘤2例。每例标本离体后分成2小份；1份甲醛固定后石蜡包埋，1份液氮速冻后转－80℃冰箱保存。用石蜡标本做连续切片,其中1张行HE染色,进一步核实原诊断，并作为组织学诊断标准用于评价IGF1和IGF2免疫组织化学染色。
淋巴结标本：肺癌区域淋巴结分组方法按1997年公布的标准[1]。肺癌手术中常规清扫胸内区域淋巴结，按暴露的先后和容易程度及术者的习惯，在肺叶切除术中,一般先清扫1、10组和部分9、12组淋巴结；在全肺切除术中,则先清扫10、9组和部分7、5组淋巴结，切除并移出肺标本后,再剪开纵隔胸膜清扫上、下纵隔各组淋巴结。肺内淋巴结则在术后从肺标本中取出。各组淋巴结标记后分别送病理检查,以诊断有无癌转移。
1.2 免疫组织化学染色
采用碱性磷酸酶标记的免疫染色法。切片脱蜡水化，置入柠檬酸缓冲液内，用高压锅加热达满压力后再持续1.5s。冷却，TBS缓冲液冲洗。血清封闭后，分别滴加鼠抗人单克隆IGF抗体(美国Upstate Biotechnology产品)：抗IGF1抗体Clone Sm1.2，浓度为5μg/ml；抗IGF2抗体Clone S1F2，浓度为8.3μg/ml。4℃冰箱过夜。加生物素化猴抗鼠IgG(德国Dianova产品)。加抗生物素碱性磷酸酶复合物(美国Vector Laboratories Inc产品)。以ASBI磷酸盐萘酚作为底物，以新品红作为色原体显现组织中的免疫反应。常规脱水、透明、封片。每次实验设阳性和阴性对照。IGFs免疫组织化学反应的评价标准：无着色或弱着色细胞<5%为阴性；明显着色且着色细胞≥5％为阳性。
1.3 免疫印迹技术
采用显微分离技术，将冷冻标本中的恶性肺组织分离并融化。将蛋白质混合物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳展开，再电转印于PVDF膜上。用与免疫组织化学染色相同的抗IGF1或IGF2抗体（浓度均为1μg/ml）与膜在室温下孵化2h。再与过氧化物酶标记的抗鼠IgG抗体(1∶2 000)作用。采用增强化学发光法检测膜免疫反应条带。
1.4 分组与统计分析
将病例按淋巴结转移情况分为有或无淋巴结转移组；其中，有淋巴结转移组参照文献[3]并结合本研究资料分布特点，进一步按淋巴结分期分为N1和N2组，按转移淋巴结个数分为<5和≥5个淋巴结转移组，按淋巴结转移组数分为一组和多组转移。用卡方检验检测组间IGF1和IGF2表达的差异性，如P<0.05，则认为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 IGF1和IGF2免疫反应特性
与阳性对照结果一致，IGF1和IGF2在肺组织中的表达位于胞浆，见图1、2。在阴性对照组织中无IGF1或IGF2着色。免疫印迹实验在免疫组织化学IGF1和IGF2阳性对应肺癌组织中分别检测出对应分子量为7.7和7.5kDa的蛋白条带。
2.2 IGF1、IGF2在良性肺组织和肺癌组织中的表达
IGF1和IGF2在肺良性病变组织中的表达率为15.8％(3/19)和21.0％（4/19），在癌旁肺组织中的表达率为13.8％（4/29）和20.7％(6/29)，在肺癌组织中的表达率为44.6％（29/65）和50.8％（33/65）。IGF1、IGF2在良性肺病变组织和癌旁肺组织中的表达无显著性差异，但均显著低于肺癌组织中的表达（IGF1的P分别为0.0228和0.0038，IGF2的P分别为0.0217和0.0063）。
2.3 IGF1、IGF2表达与肺癌淋巴结转移的关系
1A：IGF1在肺鳞癌中表达(ABCAP法 ×250)；2A：IGF2在肺鳞癌中表达 (ABCAP法 ×350)
1B：IGF1在肺腺癌中表达(ABCAP法 ×300)；2B：IGF2在肺腺癌中表达 (ABCAP法 ×300)
用免疫组织化学IGF1或IGF2阳性的肺癌组织(T)做免疫印迹实验，检测出分子量为7.7kDa(A)或7.5kDa(B)的蛋白条带；T1～T5：病例序号。
IGF1和IGF2在伴有区域淋巴结转移肺癌中的表达显著高于无淋巴结转移肺癌组织。IGF1和IGF2在伴有N2或≥5个转移淋巴结肺癌组织中的表达显著高于在仅伴有N1或<5个转移淋巴结肺癌组织。IGF2在伴有多组淋巴结转移肺癌组织中的表达显著高于仅有一组淋巴结转移肺癌组织，但IGF1在伴有一组或多组淋巴结转移肺癌组织中的表达无统计学意义。
3 讨论
本研究所用一抗是抗人IGF1和IGF2单克隆抗体，其特异性已在很多研究中得到证实。本研究采用阳性、阴性对照方法也证实了所做免疫反应和所使用抗体的特异性，此外，采用相同的抗体做免疫印迹实验，能在免疫组织化学IGF1和IGF2阳性的组织中检测出特异性的IGF1和IGF2蛋白条带，进一步证实了本研究结果的特异性。
研究发现IGFs mRNA在人非小细胞肺癌体外培养细胞系和人体肺癌组织中表达。与之相符，本研究发现，IGFs蛋白在NSCLC中过表达，这些结果提示IGFs在肺癌的发生过程中可能发挥重要作用。
本研究发现，IGF1和IGF2表达在有淋巴结转移组显著高于无淋巴结转移组(P分别为0.0149和0.0077)，提示IGFs在肺癌转移中可能起重要作用。肿瘤生长、浸润和转移的基本要素和先决条件是瘤细胞不断增殖的能力。IGFs通过自分泌和旁分泌方式在肺癌组织中表达，与胰岛素样生长因子I受体结合后激活MAPK和PI3K/AKT两条重要的信号传导通路，促进肺癌细胞增殖和抗凋亡。我们的研究和最近不少研究表明，这两条信号通路在肺癌发生和发展中起重要作用，甚至可能是治疗肺癌的有效靶点。事实上，IGFs对包括肺癌细胞在内的许多肿瘤细胞具有强有力的刺激增殖作用。因此，IGFs通过促进细胞增殖和抗凋亡在NSCLC转移中可能起着重要作用。
此外，本研究在进一步分析IGFs表达与NSCLC淋巴结转移部位的关系时发现，伴有N2淋巴结转移肺癌的IGFs表达显著高于仅伴N1淋巴结转移肺癌，进一步提示IGFs在肺癌转移中起重要作用，这一结果反过来也为肺癌淋巴结分期提供分子生物学依据。但目前的淋巴结分期标准仅考虑淋巴结转移的部位及范围，而没有考虑转移淋巴结的数量；研究表明，肺癌的预后与淋巴结转移的部位和数量均显著相关。本研究发现，IGFs在伴有5个或以上转移淋巴结肺癌组织中的表达显著高于仅伴有5个以下转移淋巴结肺癌组织；相似地，IGFs在伴有多组淋巴结转移肺癌组织中的表达显著高于仅有一组淋巴结转移肺癌组织，提示IGFs表达与淋巴结转移的部位、范围、数量及组数均有关系，因此，检测IGFs表达将有助于判断肺癌的生物学行为。
综上所述，IGFs不仅在非小细胞肺癌中过表达，而且与其区域淋巴结转移相关联，提示IGFs在NSCLC发生和发展中可能起重要作用，IGFs为肺癌生物学行为尤其是淋巴结转移的判断提供一个新的有意义的指标。
