survivin 是一类仅在肿瘤细胞中表达的凋亡抑制因子(Inhibitor of apoptosis,IAP),在肿瘤的发生、发展过程中具有重要作用。研究表明，抑制survivin基因的表达可介导肿瘤细胞的凋亡，进而抑制肿瘤的生长。本实验选择和设计针对survivin编码基因的siRNA靶序列,通过人工合成靶序列后构建表达siRNA靶序列的载体，并转染云南个旧肺鳞癌细胞株YTMLC细胞，观察siRNA 能否诱导肿瘤细胞内源性survivin表达的沉默并介导肿瘤细胞的凋亡增加，为肿瘤的基因沉寂疗法提供实验基础。
1材料和方法
siRNA表达质粒pGE1 和非特异对照质粒pshRNAnegative 购自Stratagene公司;大肠杆菌SCS1购自Stratagene公司。云南个旧肺鳞癌细胞株YTMLC细胞由本研究所保存。
去内毒素质粒DNA小量提取试剂盒和小量DNA切胶回收纯化试剂盒，小量细胞总RNA快速抽提纯化试剂盒为上海华舜生物工程有限公司产品；RTPCR 试剂盒为Fermentas产品；内切酶、Taq酶、T4 DNA连接酶和DL2000 Marker购自TaKaRa 公司; 一抗为survivin兔IgG多抗(FL142)购自Santa Cruz 公司；二抗为FITC标记山羊抗兔IgG（H+L）购自北京中杉金桥公司;转染试剂LipofectamineTM 2000 购自Invitrogen 公司; PIAnnexin V双染试剂盒购自Immuntech公司;引物和寡聚核苷酸片段均由上海生工生物工程公司合成；DMSO、Tris碱和甘氨酸购自Sigma公司；细胞培养用RPMI1640购自Gibco/BRL公司；新生牛血清购自杭州四季青公司；其他试剂均为国产分析纯。
靶向survivin的siRNA表达载体的靶序列的选择和合成。上述合成的正义和反义的寡聚核苷酸片段等比例混合后经过93℃变性3min后退火30min得到双链寡聚核苷酸片段，PCR产物使用4%琼脂糖电泳检测并进行序列鉴定。
YTMLC细胞常规培养于含10%新生牛血清、100U/ ml 青霉素、100U/ ml链霉素的RPMI1640培养液中,培养条件为37℃,CO2 饱和度为5%，定期观察细胞生长情况,每2～3d用0.25%的胰酶消化,进行传代培养。
转染72h后，6孔板的各孔细胞用PBS洗涤2次,4%多聚甲醛室温固定30min，之后用3%BSA 37℃封闭2h，一抗为兔抗survivin (Santa Cruz,USA) 1∶500加入37℃孵育2h,二抗为FITC标记山羊抗兔IgG（H+L）1∶5000加入37℃孵育1h。FITC标记的兔抗survivin 在荧光显微镜下(激发波长488nm，发射波长520nm) 呈绿色,观察荧光表达变化并照相。 随机选择5 个细胞区内200 倍(20×10倍) 视野,计数绿色荧光细胞数及总细胞数,计算绿色荧光细胞抑制率= [总细胞数 绿色荧光细胞数] / 总细胞数×100 %。并对绿色荧光细胞抑制率作统计学分析。
PCR产物通过2%琼脂糖电泳检测。根据凝胶电泳中内源GAPDH 基因片段条带的强弱,来判定模板的量,进而确定survivin 基因的mRNA 被siRNA 沉寂的程度。survivin基因的mRNA 沉寂率= [细胞组的survivin PCR产物条带亮度OD值－重组质粒pshRNA－survivin 组的survivin PCR产物条带亮度OD值] /细胞组的survivin PCR产物条带亮度OD值×100%。
转染6孔板的各组细胞72h后分别用0.25%胰酶消化，将正常细胞组和诱导凋亡组的悬浮成细胞浓度为1×105后，PBS洗涤2次。加入100μl Binding Buffer（10mM HEPES,140mM NaCl,2.5mM CaCl2,pH7.4）和 FITC 标记的AnnexinV(20μg/ml)10μl重悬,室温避光30min，再加入PI(50μg/ml)5μl，避光反应5min后，加入400μl Binding Buffer，立即用使用EPTC SXL31240 Flow Cytometry (Coulter CO.)进行流式细胞术定量检测,其波长为488nm，同时以不加FITC 标记的AnnexinV和PI的一管作为阴性对照。
实验结果采用SPSS 12.0 软件进行统计学分析，用方差分析各组间差别。
2结果
结果表明，构建的pshRNAsurvivin1 和pshRNAsurvivin2 两种siRNA 均能在肿瘤细胞中明显促进YTMLC细胞的凋亡；转染非特异对照组pshRNAnegative的细胞无明显YTMLC细胞凋亡增加，表明非特异对照组pshRNAnegative 不能促进YTMLC细胞的凋亡，验证了pshRNAsurvivin 作用的特异性。
3讨论
凋亡抑制因子survivin是近年来发现的凋亡抑制蛋白(Inhibitor of apoptosis proteins,IAP) 家族新成员,survivin具有高度保守性和调节细胞分化、抑制凋亡的功能。研究发现，与其他的IAP蛋白相比，生存素有许多独特的特点，其组织分布有明显特征性,它在除胎盘、胸腺和生殖腺外的成人终末分化组织及癌旁组织一般无表达，而当细胞发生转化或恶性变时又重新表达，包括肝癌、肺癌等大多数恶性肿瘤中呈高表达。另外它在癌组织中的表达是一个渐进的过程，随着癌前细胞向癌细胞的转化，survivin的表达逐渐升高。在结肠癌、直肠癌、乳腺癌、
非小细胞肺癌、胃癌以及神经母细胞瘤的研究提示survivin的表达可以作为预后不良的标志。有证据显示survivin是迄今为止发现的最强的凋亡抑制因子之一，抑制肿瘤细胞survivin的功能可以促进肿瘤细胞凋亡而起到治疗肿瘤的作用。研究证明：survivin在肿瘤组织的高表达和表达的特异性，在100多种肿瘤特异性表达基因中，其表达特异性名列第3。
研究表明，人工合成的survivin反义寡核苷酸、反义RNA、核酶和负显性突变体导入肿瘤细胞内能抑制survivin 基因的表达,促进肿瘤细胞凋亡。RNA干扰(RNAi) 是自然界生物体的一种遗传现象,其主要是利用双链RNA 特异性介导其互补同源mRNA 序列的降解,从而特异性抑制目的蛋白的表达,抑制作用强[8]。研究发现RNAi 抑制目的基因的作用强于反义寡核苷酸。近年来广泛应用的RNA干扰技术(RNA interference,RNAi),RNAi的技术优势包括：RNAi基因的抑制效果确切，抑制具有严格的序列特异性，治疗的针对性强，以及其具有级联放大效应和高穿透性更适合于恶性肿瘤的实验研究，因此，RNAi技术在肿瘤的基因治疗上具有光明的应用前景。自发现以来,已广泛应用于基因功能、肿瘤和病毒性疾病等的研究。Kappler等应用小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)降低五种分别具有野生型及突变的p53基因的肉瘤细胞的survivin的表达,其结果提示不论肉瘤细胞是否表达野生型p53基因,靶向survivin的siRNA可以将其特异性地杀灭。Williams等研究发现,无论是体外的结肠癌细胞HCT116还是体内的HCT116异种移植物,应用RNAi技术阻断survivin表达可显著抑制其生长。
本研究为survivin 介导的肿瘤基因沉寂疗法提供良好的实验基础，特别是为云南肺癌的治疗带来了新思路。
由于本实验利用DNA载体在细胞内转录mRNA而发挥作用，克服了合成RNA成本高、费用大的缺点，更利于RNAi技术的推广利用。但本研究，在survivin靶序列的选择方面没有进行更进一步的尝试，所以今后应加强优选靶序列及其生物学效应的比较。RNA干扰技术运用于肿瘤治疗的研究才刚刚起步，但已表现出巨大的潜力，或会成为肿瘤治疗的新希望。
(编辑:刘辉)
