胃癌的发生涉及癌基因功能增强，抑癌基因突变或功能缺失。作为第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因PTEN（Phosphates and Tension homolog deleted on chromosome Ten），在多种肿瘤中存在失活现象，其失活的原因除突变、缺失外，5’CpG岛异常甲基化可能是其失活的第三条途径。本研究采用敏感的甲基化特异性PCR（MSP）方法检测PTEN基因启动子在四种不同分化程度的胃癌细胞中的甲基化状态，并通过RTPCR和Western blot法检测该四种细胞中PTEN mRNA水平和蛋白表达，探讨PTEN甲基化改变、表达异常与胃癌的关系，为胃癌的发生机制提供分子生物学依据，以期为胃癌的治疗探索新途径。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞系 胃癌细胞HGC27(未分化),MGC803,BGC823(低分化),SGC7901(中分化)购自上海生命科学研究院。
1.1.2 主要试剂 Trizol试剂盒，RPMI1640培养基(Gibco公司)；胎牛血清(Hyclone公司)；亚硫酸氢钠，氢醌，鼠抗人βactin抗体，硝酸纤维素膜(Sigma公司)；Wizard DNA clean up system(Promega公司)；Sss1酶(New England Biolabs公司)；小鼠抗人PTEN抗体，ECL试剂盒(Santa Cruz公司)；PTEN甲基化和未甲基化引物及PTEN和β表1 用于MSP、RTPCR各引物序列、产物大小和退火温度注：MSP两对引物中经亚硫酸氢钠处理后改变的碱基用黑体字标出，甲基化和非甲基化引物序列中碱基的不同用下划线标出ctin引物由上海生工合成。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 4种细胞用含10%胎牛血清(56℃灭活30min)，100u/ml青霉素和100u/ml链霉素的RPMI1640培养液(pH7.2)，在37℃、5 %的CO2培养箱中培养。
1.2.2 RTPCR检测PTEN mRNA水平 Trizol一步法提取细胞总RNA，经逆转录后再以cDNA为摸板扩增。PTEN基因和βactin的引物序列，见表1。PTEN PCR反应条件：94℃ 3min，以94℃30s，54℃30s，72℃45s循环20次，72℃延伸7min；βactin PCR反应条件：94℃ 3min，以94℃40s，56℃45s，72 ℃60s循环20次，72 ℃延伸7min。1.5％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统拍照并检测吸光度值，将PTEN与βactin吸光度比值作为其mRNA水平的相对值。重复实验6次，取均值。
1.2.3 Western Blot法检测PTEN基因蛋白表达水平 提取细胞总蛋白，Bradford法测蛋白浓度。10％PAGE凝胶电泳，电转，加入一抗二抗，显色。暗室内X光底片感光成像并进行图像分析，计算条带的积分吸光度(IA)，将PTEN与βactin吸光度值的比值作为其蛋白表达的相对值。上述步骤重复6次，取均值。
1.2.4 DNA的提取、修饰和纯化 用经典的蛋白酶K苯酚氯仿法抽提细胞DNA，参照Herman的方法[1]，依次采用氢醌及亚硫酸氢钠，Wizard DNA clean up试剂盒修饰，纯化DNA。完全甲基化对照是将正常人外周血淋巴细胞DNA与SAM(终浓度160μM),1×NEBuffer2和1U的Sss1酶共同37℃孵育2h后再经亚硫酸氢钠修饰；完全未甲基化对照仅用亚硫酸氢钠处理；阴性对照分别用没有经亚硫酸氢钠处理的DNA和H2O代替模板DNA进行PCR。
1.2.5 MSP 引物设计根据PTEN基因序列(GenBank accession number AF143312),MethPrimer软件，并参照Salvesen HB,Kang GH,Kang YH等[24]合成，见表1。25μl PCR反应总体系为：10×Taq酶Buffer 2.5μl，dNTP 2.0μl(终浓度200μM)，Taq酶0.5μl(1u)，上下游引物各25pmol，MgCL 1.0μl，模板DNA 2～3μl，补足水至25μl。反应条件为：94℃热启动11min后开始35个循环：94℃40s，63℃45s，72℃1min，最后于72℃延伸12min，4℃保存。产物经8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳溴化乙锭染色后在紫外光下观察，凝胶成像系统拍照。
1.3 统计学分析
所有数据用±s表示，用SPSS11.5软件进行统计学分析，P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 PTEN mRNA和蛋白表达水平 见表2。
mRNA和蛋白水平SGC7901细胞显著高于HGC27细胞(t=18.1536,P<0.01)及MGC803和BGC823细胞(t=9.010,P<0.01；t=7.4567,P<0.01)，后两者显著高于HGC27细胞(t=9.14,P<0.01；t=10.697,P<0.01)，但是MGC803和BGC823细胞之间蛋白表达水平无明显差异(t=1.5535,P>0.05)。如图1、2所示。可见随着胃癌细胞分化程度的降低，PTEN mRNA和蛋白表达逐渐减少，两者呈正相关趋势。表2 四种胃癌细胞中PTEN mRNA和 蛋白表达水平
2.2 PTEN基因启动子区CpG岛的甲基化状态
HGC27(未分化)、MGC803、BGC823(低分化)细胞，两种引物均有目的片段的扩增，提示了这三种细胞PTEN基因CpG岛发生了部分程度甲基化，SGC7901(中分化)只有PTENU有目的片段的扩增，提示其没有发生甲基化。完全甲基化阳性对照只扩增出206bp的条带，完全未甲基化阳性对照只扩增出162bp的条带，阴性对照均无目的条带扩增，见图3。
3 讨论
自从抑癌基因PTEN被发现，至今已发现包括胃癌在内的多种肿瘤中都存在着PTEN改变，如子宫内膜癌、卵巢癌、宫颈癌、乳腺癌、恶性黑色素瘤、非小细胞肺癌[58]。肿瘤细胞中导致PTEN基因沉默的原因之一是缺失和突变；导致PTEN沉默的另一原因即是其5’启动子区的CpG岛甲基化。PTEN基因的CpG岛甲基化将导致转录抑制，进而导致其表达产物PTEN蛋白的减少甚至缺失。
本实验研究了四种胃癌细胞甲基化状态及其mRNA水平和蛋白的表达。HGC27(未分化)、MGC803、BGC823(低分化)细胞PTEN基因启动子区CpG岛可检测到甲基化，SGC7901(中分化)细胞则未检测到甲基化，且细胞分化程度越低，PTEN mRNA与蛋白表达水平越低。这一结果与Kang等、Kang等的报道一起说明PTEN在人胃癌细胞和组织中均发生了一定程度的甲基化，这可能是引起PTEN mRNA表达减少并导致其蛋白表达减少或缺失的机制之一，但是，Sato等研究却认为PTEN并未发生甲基化。这可能是由于PTEN基因启动子区富含的CpG岛并未全部发生甲基化，在进行PCR扩增中所设计的引物并未能针对已发生甲基化的区域扩增。另外，不同细胞株(即使是同一细胞株的不同细胞)来的DNA甲基化程度可能不一样，这都是导致结论不一的原因。另外我们发现，PTEN mRNA和蛋白表达水平与细胞分化程度呈正相关趋势。一般来说，细胞分化程度越低，其恶性程度就越高，病人预后越差。
此实验通过对PTEN基因表达和甲基化状态的研究，为胃癌的发生机制提供了分子生物学依据，也为肿瘤的治疗提供了新的思路。但该结果仅从DNA、RNA和蛋白水平分析PTEN在胃癌发生发展中的异常改变，其参与肿瘤发生发展的机制还有待于进一步研究。
(编辑:刘辉)
