环孢素Ａ(CsA)为目前肝移植术后基本抗免疫排斥药。阿霉素为肝癌常用的有效化疗药物， CsA等免疫抑制剂与阿霉素联合应用是否会增加肝癌复发一直困扰着移植外科医师。我们对此进行了深入研究，探讨其对肝癌肝移植术后应用的安全性。
1 材料与方法
1.1 材料 DNA细胞周期及细胞凋亡流式细胞检测试剂盒（BD公司）、环孢素Ａ(CsA)、四甲基偶氮唑蓝(MTT)。荧光定量仪PE 7000全自动荧光定量PCR仪购于美国Perkin Elmer公司;流式细胞仪购于BD公司。
1.2 细胞培养 人肝癌细胞HepG2购自中山大学细胞库，常规培养于DMEM完全培养液内(含10%小牛血清、100μｇ/ml青霉素和100μｇ/ml链霉素，pH7.2)，置37℃及5%CO2孵箱中培养，选对数生长期的细胞用于实验。
1.3 实验分组 CsA设为5、10、100、500、1000、5000μｇ/L，ADM设为1000μｇ/L，分成对照、CsA、ADM、CsA+ADM组。HepG2细胞分别经过24、48h处理后检测。
1.4 MTT比色法实验 取96孔细胞培养板加入相同数目细胞,培养24h,细胞贴壁,分别将FK506、CsA处理的相同数目细胞加入各个孔，同时设3个复孔，分别置于37℃、5%CO2孵箱中培养24h、48 h后，然后每孔加入15μl MTT染液，在37℃、5%CO2孵箱中培养4～6 h，每孔加入10%SDS的盐酸溶液，再置孵箱中培养过夜，最后在酶联检测仪波长570nm测OD值。
1.5 流式细胞术检测细胞凋亡 以0.25%胰蛋白酶消化后，锥虫蓝拒染法计数细胞，使收集细胞总数为1×106以上，1 500ｒ/min离心5min后，弃上清，转入1.5ml Eppendorf管内，加入冰PBS(pH7.4)缓冲液，1 500ｒ/min离心5min后，再洗1次，弃上清，缓慢加入20℃预冷的70%乙醇1.5ml，固定细胞，充分震荡，使细胞分散，加入碘化丙啶(PI)和Annexin VFITC 2种染料，各5μl，4℃保存15min后，放入流式细胞仪的样品室，采用488nm氩离子激光进行检测。
1.6 流式细胞术检测细胞周期 同上收集2×105～1×106细胞，75%冷乙醇固定10min。RNA酶消化，加碘化丙啶染液，4℃避光静置15min。用流式细胞仪进行检测。
1.7 统计学方法 采用Excel软件中的方差分析和ｔ检验进行统计学处理，以α=0.05作为检验标准。
2 结果
2.1 经CsA处理24h的肝癌细胞OD值较对照组无明显变化，作用48h后OD值较对照组明显降低（P<0.05），表明经CsA处理48h的肝癌细胞增殖能力明显受到抑制。不同浓度CsA对HepG2肝癌细胞：与对照组比较P<0.05
2.2 CsA在5～1 000μｇ/L对HepG2肝癌细胞作用48h影响随浓度增加，凋亡率逐渐增加，超过该浓度时，则出现凋亡率减低。
2.3 CsA 在200μｇ/L时对HepG2肝癌细胞作用48h影响与对照组比较，CsA使 G2/M期显著延长，对S期影响不大；单用ADM使S期显著缩短和G2/M期延长。说明二者对细胞周期影响为主要阻滞于G2/M期。CsA联合ADM应用显示CsA与 ADM对G2/M期的阻滞有无协同作用。CsA在500ng/ml对HepG2肝癌细胞有促进细胞凋亡作用，与ADM有协同促调亡作用。表2 不同浓度CsA对HepG2肝癌细胞凋亡影响：与对照组比较P<0.05；与ADM组比较P<0.05
3 讨论
尽管肝癌肝移植患者术后面临高复发率的风险，但在一部分患者中，肝移植却获得了良好效果，甚至长期生存。Cherqui等研究显示即使癌灶>5ｃｍ的患者移植术后1、3年无癌生存率分别达70%和56%，与小肝癌组移植术后生存率相近。CsA作为肝移植术后基本的免疫抑制剂，他们对肝癌的生物学影响及其与化疗合理应用有待深入研究。
我们研究表明CsA对肝癌细胞作用24h，尚无明显的细胞抑制，当作用48h，肝癌细胞增殖能力显著受到抑制，不同浓度之间无显著差别。CsA对凋亡影响却表现明显的量效关系，低浓度时凋亡增加，达一定浓度后，凋亡率骤降，呈双向作用。表明细胞生长抑制除与凋亡有关，尚有其他机制，如直接造成肝癌细胞的坏死。
ADM作为一种化疗药物，既可以直接杀伤细胞致其坏死，又可以诱导其凋亡，其机制大体有以下几点：(1)ADM进入细胞后很快与细胞核结合，一部分与线粒体和微粒体结合，它们形成的复合物可导致DNA、RNA和蛋白质合成受抑，DNA双螺旋不能卷曲，DNA链易于折断，DNA一旦受损，则不易修复；(2)合适浓度时则诱导细胞凋亡；随其浓度的增加，凋亡细胞百分率逐步增加，若浓度继续增高，凋亡率则不再增加，而坏死细胞逐渐增多。钟雪云等研究报道了阿霉素诱导肝癌细胞凋亡的阈值的研究，超过该值时，才表现凋亡率的显著增加。
我们研究发现CsA及ADM二者对细胞周期影响为主要阻滞于G2/M期。CsA对HepG2肝癌细胞有促进细胞凋亡作用，与ADM有协同促调亡作用。G2期细胞的主要特征是RNA的合成和染色质的螺旋化，此期细胞对外界环境敏感，易受各种因素的影响。这为联合作用于G2期的化疗药（阿霉素），协助肝癌治疗提供了依据。我们实验表明CsA联合ADM对体外肝癌细胞治疗有协同作用。CsA是一种免疫抑制剂，在临床肝癌肝移植术后应用CsA联合ADM对肝癌复发转移的影响，有待进一步动物实验和临床研究证实。
(编辑:刘辉)
