树突细胞(dendritic cells, DC) 是目前已知的功能最强的抗原提呈细胞(antigen presenting cells, APC)，可以在体内外向T淋巴细胞提呈抗原，并诱发CTL(细胞毒T淋巴细胞)反应。选择人外周血体外培养富集DC是研究DC的重要途径，但所面临的困难是DC在外周血中含量极微，而且DC的多源性和多功能性尚待进一步阐明。本实验我们借助于细胞因子诱导体外培养富集人外周血含量达70%～80% DC群，经形态学鉴定为两种DC群。体外分别诱导出针对肝癌细胞抗原的特异性，并用于荷瘤裸鼠的治疗以观察其抑瘤率的效果。
1 材料与方法
1.1 材料
重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（rhGMCSF），重组人白细胞介素4（rhIL4）、CD86(Sigma公司），重组人肿瘤坏死因子（rhTNFα）（校肿瘤研究所馈赠），淋巴细胞分离液（上海华精生物科技有限公司），RPMI1640、新生小牛血清（杭州四季青公司），MTT（华美生物工程公司），5周龄雌性BALB/c裸鼠[中国科学院上海实验动物研究所，动物饲养及实验在校实验动物中心（SPF级动物实验室）完成]，健康人外周血（附属医院输血科）。
1.2 方法
1.2.1 DC的体外培养及收集 据文献略作修改[1]，人外周血单个核细胞（PBMNC）以合适的密度接种于培养瓶内，适宜条件培养2h后收集未贴壁细胞（97%以上T淋巴细胞，收集另培养），继续培养24h后按3×106 细胞/10ml 培养瓶分组：将释放下来的悬浮细胞作为A组，仍然贴壁的细胞作为B组，A组及B组细胞均在含终浓度为500u/ml的rhGMCSF（1 000u/ml）及rhIL4（500u/ ml）的上述RPMI1640完全培养液中培养，A组及B组均于培养第3d向培养瓶中添加rhTNFα（终浓度500u/ml），每天半量换液，每隔3d全量换液（含上述3种细胞因子的培养液），于培养第9d收集DC群。
1.2.2 两类DC亚群的透射电镜观察细胞超微结构 于培养第12天收集足量A、B两组DC群,经PBS液洗2次后低速离心获细胞沉淀，经固定、脱水、包埋、超薄切片复染后，透射电镜观察并照相。
1.2.3 两类DC亚群活化的T淋巴细胞对肝癌细胞的特异性杀伤 分别收集活化后的淋巴细胞，按每孔5×105、2.5×105、5×104做效应细胞，靶细胞分别为SMMC7721细胞、hepG2细胞。靶细胞浓度为每孔5×105。同时做效应细胞和每种靶细胞的对照各3复孔。效应细胞与靶细胞混合培养16h后加入5mg/ml MTT10μl继续培养8h。离心培养板（2 000r/min，10min），弃去上清液，每孔加DMSO100μl，于570nm处测定A值计算各自实验结果。
1.2.4 荷瘤裸鼠模型的建立 收集对数生长期的SMMC7721细胞，接种于裸鼠背部皮下，2×106/只，抑瘤率由治疗初始肿瘤重量治疗结束时肿瘤重量/治疗初始肿瘤重量来表示。
1.2.5 两类DC亚群诱导的肿瘤抗原特异性CTL治疗荷瘤裸鼠模型 15只裸鼠中全部长出肿瘤。随机挑选5只荷瘤鼠为A群DC活化的肿瘤特异性CTL1治疗组，另选5只作为B群DC活化的肿瘤特异性CTL2治疗组，最后5只为阴性对照组。
1.2.6 统计学方法 实验结果采用SPSS统计软件进行方差分析。
2 结果
2.1 人外周血来源的两类DC亚群的形态特征观测 在倒置显微镜下观察，A、B两组培养第3～4d时可见大部分细胞呈梭形，细胞表面呈毛刺状，细胞大小约为单核细胞的1～1.5倍， A、B两组细胞在数量及形态上无显著差异。
2.2 两类DC亚群细胞超微结构 将体外培养第12d的A、B组DC群样本在透射电镜下观察，从亚细胞器的超微结构特征来看，DC群含两类DC：一类DC亚群在A组多见，其细胞表面有大量树枝状突起，细胞核形状不规则，核内异染色质沿核边高度凝聚，胞质中线粒体相当丰富，溶酶体、粗面内质网、胞饮小体数量少或无，这类DC中个别细胞表面树突粗大者，其胞浆内核糖体及光面内质网清晰可见，部分内质网扩张或有些线粒体膨胀，见图1c，提示这些细胞活动度大、供能旺盛，我们分析这类DC可能源自DC前体细胞;另一类DC群在B组皆是，其细胞结构特征为细胞呈不规则形，细胞表面粗糙，有大量皱褶及粗大树枝结节状突起，细胞核常呈肾形或马蹄形，核内异染色质边集， 胞浆内线粒体比第1类DC群相对少，高尔基体及板层溶酶体较多，这些可能是由单核细胞分化来的DC的超微结构特征。
2.3 两类DC亚群活化的淋巴细胞对肝癌细胞的特异性杀伤 负载肝癌SMMC7721细胞可溶性抗原后两类DC亚群活化的T细胞，对SMMC7721细胞、hepG2细胞均有不同程度的杀伤作用，杀伤效果明显高于非特异性淋巴细胞对照组且由B群DC活化的CTL2治疗组的杀伤效果高于由A群DC活化的CTL1治疗组的杀伤效果。
2.4 肝癌荷瘤鼠模型的建立 在接种后的7天内15只裸鼠全部长出肿瘤，荷瘤鼠平均重量变化及肿瘤平均重量。
2.5 两类DC亚群诱导的肿瘤抗原特异性CTL1、CTL2对荷瘤裸鼠模型的治疗作用观察 以被激活的CTL治疗裸鼠已生长出的SMMC7721移植瘤，接种后的第35天对照组、A群DC诱导的CTL1治疗组及B群DC诱导的CTL2治疗组裸鼠的体重变化、移植瘤的重量变化、及抑瘤率。其生长曲线。结果显示与对照组相比，CTL1治疗组及CTL2治疗组移植瘤生长均受到不同程度抑制（P＜0.05，P＜0.01）。在两治疗组中，CTL2治疗组移植瘤生长受到抑制更明显（P＜0.05）。
3 讨论
鉴于DC是免疫系统中一类最重要的抗原提呈细胞（APC），在启动T细胞免疫应答和T细胞依赖性应答中起关键作用，近年来对DC的临床研究愈来愈令人瞩目。
我们观察到人外周血PBMNC经移弃大部分T细胞后，再于RPMI1640完全培养液中继续培养24h获取贴壁单核细胞CD14+ ，经细胞因子联合刺激培养获取的DC群变为CD14并诱导分化为两类DC亚群，借助于透射电镜观察到，从A、B 两组人外周血富集的DC群（尤其是B组DC群）中相当一部分DC的胞膜和胞浆近膜侧有许多清晰可见的溶酶体，显示DC具有饱饮活性，这可能提示B组DC群抗肿瘤的能力更强。单核巨噬细胞和DC具有高度的派生、表型、功能和分子可塑性，它们源自骨髓中共同的多能造血祖细胞。有文献报道，由CD34+细胞分化而来的DC（CD34+ progenitor cellderived DC，PCDC)和由单核细胞衍生来的DC(monocytederived DC，MoDC) 的功能性质所有不同， PCDC可能比MoDC 更适合用于肿瘤的免疫治疗。
两类DC亚群，经SMMC7721细胞的可溶性抗原刺激后在体外诱导自体T淋巴细胞分别产生CTL，两类DC亚群诱导的CTL对SMMC7721细胞与hepG2细胞杀伤率差异性说明两类DC亚群诱导的CTL存在差异性和较高的特异性，进一步在荷瘤裸鼠模型进行治疗性研究发现，B组DC群诱导的CTL具有显著的抑瘤效应，与A组DC群治疗组诱导的CTL及对照组相比，差异具有显著性。体内实验产生抗肿瘤效应结果与体外实验的结果一致。
本研究结果为我们进一步从人外周血分离富集DC，采用抗原特异性DCs激发肿瘤抗原特异性自体T细胞并输注给肿瘤患者的过继免疫疗法提供了新思路，值得进一步研究。
(编辑:刘辉)
