细胞自噬（autophagy）与细胞凋亡（apoptosis）的调控机制有关，除了凋亡以外，自噬也可能是一种肿瘤抑制机制[1]。有着明显自噬特征的细胞凋亡称为“自噬性凋亡”（autophagic apoptosis）。现认为caspase蛋白酶家族中的caspase3是哺乳动物细胞凋亡的关键蛋白酶[5]。本研究采用抗肿瘤药长春新碱（vincristine,VCR）诱导人肝癌细胞系HepG2自噬性凋亡，在此凋亡模型[4]基础上，试图从发生自噬性凋亡的细胞中克隆并鉴定caspase3基因，以研究长春新碱诱导的自噬性凋亡是否也与caspase3有关。
1材料和方法
1.1细胞及培养
人肝癌细胞系HepG2细胞（购自上海中科院细胞所）用含10％小牛血清的RPMI-1640 (Gibco BRL) 常规培养。
1.2细胞分组与加药处理
细胞分3组：未加药对照组（药物为零剂量）、VCR（sigma）作用4h组、VCR作用16h组。VCR组的药物处理基本同文献[5]之自噬性凋亡细胞模型制作，即于培养细胞中加入1μg·ml-1的VCR进行诱导。各组分别于药物作用4h、16h后收获细胞继续以下实验。
1.3RNA分离
以TRIzol Reagent RNA 分离液(GIBCO BRL)提取细胞总RNA，用紫外分光光度计测定浓度后，将RNA样品作电泳质量分析后备用。
2结果
2.1总RNA电泳
从细胞中提取的总RNA经电泳鉴定可见清晰的18s、28s两条带。
2.2PCR扩增产物电泳
取PCR扩增产物电泳，结果可见两条清晰的扩增条带，一条为496bp的GAPDH内对照扩增产物带；另一条为目的基因扩增片断，大小为625bp，其片断大小与我们设计的理论预计值相符，未见非特异扩增带。
2.3PCR扩增片段核苷酸序列测定结果
对扩增片段测序结果测出625bp核苷酸片段，与设计的引物间核苷酸片段长度一致。
2.4核苷酸序列同源性检索及比对
引物间核苷酸序列与Genebank报道的caspase3序列（检索号为NM_004346）同源性为100%。用Blast软件行序列分析结果显示引物间核苷酸序列与报道的CPP32β/Yama(caspase3)cDNA序列完全一致。
3讨论
经过一系列研究，作者认为“自噬性凋亡”是细胞凋亡的一种特殊类型，自噬性凋亡有着明显的自噬特征。其他一些学者也对细胞凋亡作了类似的分类，并认为自噬才是这类细胞凋亡的真正原因。
现普遍认为半胱天冬酶类(caspases)是凋亡信号传导的共同通路，该蛋白酶家族成员之一的caspase3在其中起着核心作用。为了阐明长春新碱诱导的自噬性凋亡是否也依赖于caspases，作者进行了上述实验，在已建立的长春新碱诱导HepG2细胞自噬性凋亡之细胞模型基础上，试图从发生自噬性凋亡的细胞中克隆caspase3基因。
长春新碱属于长春碱类抗肿瘤药，据报道这类药物可诱导细胞自噬的发生，也能诱导肿瘤细胞凋亡。HepG2细胞在VCR诱导之后先后出现两个阶段的变化：自噬阶段和凋亡阶段。自噬阶段发生于VCR作用的初期，并贯穿整个细胞变化过程；而凋亡阶段主要出现于VCR处理8h之后，在药物作用16h时凋亡细胞数量达到很高的程度。作者分别以3组不同的HepG2细胞总RNA为模板，经RT后在caspase3的特异引物引导下进行PCR扩增，625bp的扩增产物其大小与设计的caspase3基因片段相符，结果并显示VCR作用4h组、16h组的细胞中均有caspase3 mRNA的表达。并可看出，从VCR作用4～16h即从自噬到自噬性凋亡过程中，caspase3的mRNA表达呈增强趋势。本实验采用GAPDH作为内对照，三组样本均获得同样的GAPDH扩增产物带,说明用于RTPCR的三组起始RNA的量基本相同，所获结果具有可比性。
将PCR扩增产物经测序及同源性比较分析后的结果表明，分离得到的基因片断与Genebank报道的caspase3 基因序列完全一致，提示作者从VCR诱导的自噬性凋亡HepG2细胞中克隆的基因片断为caspase3基因片断。虽然实验获得的只是caspase3的一段序列，但该实验证明caspase3参与了VCR诱导的HepG2细胞自噬性凋亡。caspase3基因可能是该自噬性凋亡的枢纽元件。自噬和凋亡可能使用着某些共同的调节机制，自噬的抑制可以影响长春新碱诱导的肝癌细胞自噬性凋亡。自噬也可能是一种肿瘤抑制机制，自噬及自噬性凋亡的调控可能均与肿瘤的调控机制有关。
(编辑:刘辉)
